St. Stephan ist eine der ältesten Kirchen Würzburgs. Ihre Geschichte reicht bis ins Jahr 1014 zurück und wurde durch Bischof Heinrich I. von Würzburg (996–1018) als Chorherrenstift gegründet. Der Übergang zum Kloster erfolgte unter Bischof Adalbero (Bischof von 1045–1077/90) im Jahre 1057; die Kirche war seitdem Abteikirche. Die Kanoniker siedelten in diesem Jahr in das neu gegründete Kollegiatstift Neumünster über. Die erstmalige Erwähnung des heiligen Stephan als Klosterpatron erfolgte in der Schenkungsurkunde aus dem Jahr 1108. In den ersten Jahren war das Kloster ein Doppelkloster. Die Existenz des Frauenkonvents in St. Stephan sowie des Klosters St. Afra ist schon vor 1151 nachweisbar. Die Übersiedlung der Nonnen aus St. Stephan nach St. Afra erfolgte Ende des 12. Jahrhunderts. Bemühungen des Klosters um Reichsfreiheit Anfang des 15. Jahrhunderts scheiterten. Der wirtschaftlichen Krise des Klosters in der zweiten Hälfte des 16. Jahrhunderts folgte eine rasche Konsolidierung bis Anfang des 17. Jahrhunderts. Das Kloster wurde 1803 im Zuge der Säkularisation aufgelöst.
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